Doch die Stadt konnte sich nicht einfach der Re­for­mation anschlie­ßen. Sie war dem katho­li­schen Kaiser direkt unterstellt, umgeben und auch ab­hän­gig vom Handel mit dem katholischen Bayern, mit einem Bischof in­ner­halb der Mau­ern, der al­les Verdächtige sofort an den Kaiser meldete.
So versuchte man es zunächst mit „cancel cul­ture“. Der Verkauf von Luthers Schriften wurde un­ter­sagt, der unbequeme Blauhans nach einem Auf­ruhr in der Kirche der Stadt ver­wiesen. Er kam aber bald wieder zurück, mit einem Brief Luthers im Gepäck, und die Lage beruhigte sich keines­wegs. Im­mer mehr Einwohner gingen nach Sal­lern und Beratz­hausen zu evange­lischen Predi­gern in den Got­­tes­dienst. Immer mehr Trau­un­gen fanden ohne Pries­ter statt, Nonnen und Mönche traten aus ih­ren Klös­tern aus und heirateten. Die Stadt blieb noch fast zwei Jahrzehnte offiziell ka­tho­lisch, wäh­­rend der Druck der Bevöl­kerung ste­tig zunahm.
Erst 1542 stellte der Rat den ersten evan­ge­lischen Prediger an. Seine Predigten fanden enormen Zu­lauf, ebenso die Abendmahl­fei­ern auf reformato­ri­sche Weise. Im Oktober 1542 schließ­lich gab der Rat den Bürgern nach und Re­gens­burg schloss sich der Re­for­mation an. Nach der Unterzeich­nung des Augsburger Reli­gions­­frie­­dens 1555 gab es in Regens­burg nur noch zwei ka­tholische Bürger (und freilich zahlreiche katho­lische Klöster, die auch wei­ter­hin Bestand hatten). Für ein paar Jahr­hunderte blieb die Stadt über­wiegend protes­tantisch.
Die Dreieinig­keits­kir­che ist der erste evange­lische Kir­chen­neubau in Altbayern. Sie wur­de  zum Groß­teil aus Spenden finanziert und war für ihre besondere Bau­art weithin berühmt: zum einen auf­grund ihrer Rund­fenster, die der Beleuchtung der Emporen­un­ter­­räume diente. Vor allem aber ge­ra­de für das, was hier im Ge­gensatz zu den meis­ten ande­ren Kirchen dieser Größe fehlte: Säu­len und andere Stützen. Nicht einmal unter den um­lau­fen­den Holzemporen gibt es sie, was ei­nen guten Blick auf Altar und Kanzel ermöglicht.